質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展和應(yīng)用有目共睹。學(xué)物理出身、從事科學(xué)研究的質(zhì)譜學(xué)者會(huì)做出什么樣的選擇？數(shù)年前在北京質(zhì)譜年會(huì)上，第一次聽(tīng)聶宗秀的報(bào)告時(shí)就印象深刻，用離子阱質(zhì)譜測(cè)定數(shù)百兆分子量的大顆粒的工作讓人耳目一新。如果說(shuō)探索高質(zhì)量極限的工作還不夠引人注意，那么用MALDI測(cè)定那些以前不能測(cè)定的納米顆粒，最終對(duì)生物組織內(nèi)的納米顆粒進(jìn)行成像的工作，則得到大家的認(rèn)可，該工作不僅發(fā)表在Nature Nanotech.上，而且由雜志社撰文在同期的“新聞視角”中進(jìn)行了專欄評(píng)論，被Chem. Res. Toxicol.選為“研究亮點(diǎn)”，入選2016年Nature Nanotech.雜志10周年專刊。同時(shí)，該工作也是中國(guó)學(xué)者發(fā)表的比較有影響的質(zhì)譜成像工作之一。不久前，采訪了中科院化學(xué)所聶宗秀研究員，他詳解了自己在探索質(zhì)譜測(cè)定超大分子、小分子兩端極限的工作，以及前沿的MALDI質(zhì)譜成像工作，希望對(duì)所有關(guān)注質(zhì)譜及其應(yīng)用的讀者有啟發(fā)……
探索質(zhì)譜兩極限：生物分子大顆粒質(zhì)譜和MALDI高通量分析小分子
聶宗秀研究員首先簡(jiǎn)介了自己的主要研究工作：用于分析超大分子量顆粒的離子阱質(zhì)譜；MALDI質(zhì)譜及質(zhì)譜成像的研究。
2005-2007年，在臺(tái)灣中央研究院原子與分子科學(xué)研究所做博士后時(shí)，聶宗秀跟隨張煥正教授研究分析大分子量顆粒的離子阱質(zhì)譜。商用質(zhì)譜測(cè)量顆粒的粒徑范圍一般小于10 nm，無(wú)法分析超過(guò)10 nm粒徑或100萬(wàn)Dalton分子量的顆粒。而分析>10 nm、>100萬(wàn)Dalton的大分子顆粒在生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)和材料科學(xué)領(lǐng)域都有重要的應(yīng)用。在導(dǎo)師指導(dǎo)下，聶宗秀和導(dǎo)師設(shè)計(jì)了特殊的離子阱質(zhì)譜，通過(guò)對(duì)完整顆粒的電離測(cè)量，可以研究單個(gè)完整的細(xì)胞、細(xì)菌和病毒。
在臺(tái)灣還因?yàn)榱硪粋€(gè)課題接觸了MALDI，但發(fā)現(xiàn)當(dāng)時(shí)MALDI都是分析蛋白，沒(méi)辦法分析小分子。2007年聶宗秀到普渡大學(xué)Graham Cooks教授實(shí)驗(yàn)室從事博士后研究，主要工作是搭建一臺(tái)離子軟著陸質(zhì)譜儀及一些小型化質(zhì)譜。軟著陸質(zhì)譜儀可使粒子帶電后，軟軟地著陸在一個(gè)表面上，離子不會(huì)碎裂。2009年聶宗秀到中科院化學(xué)所后繼續(xù)開(kāi)展顆粒質(zhì)譜儀和MALDI的研究工作。
帶著以前的疑問(wèn)，聶宗秀開(kāi)始對(duì)MALDI深入研究。第一個(gè)興趣點(diǎn)是：MALDI顯然是高通量的方法，但目前主要用于分析檢測(cè)蛋白質(zhì)等大分子，因?yàn)樵贛ALDI分析小分子時(shí)常存在嚴(yán)重的基質(zhì)干擾，因此這種高通量的方法無(wú)法有效分析小分子，有人甚至說(shuō)“用高通量的MALDI分析小分子是高射炮打蚊子”。聶宗秀卻認(rèn)為，用MALDI高通量分析小分子大有可為。這是因?yàn)?，尋找癌癥的生物標(biāo)志物方法有三個(gè)層次，首先是尋找變異基因，其次是用蛋白質(zhì)組學(xué)方法。而第三個(gè)層次是：蛋白質(zhì)組學(xué)變化后，其小分子代謝物也進(jìn)一步發(fā)生變化，這就是代謝組學(xué)的研究層次。代謝物都是小分子，所以課題組想從小分子的角度研究癌癥的早期發(fā)展和代謝標(biāo)志物。用MALDI做代謝組學(xué)分析時(shí)面臨的一大難題就是沒(méi)有合適的小分子基質(zhì)。聶宗秀課題組2012年發(fā)表多篇文章，介紹其發(fā)現(xiàn)的適合于小分子分析的MALDI新基質(zhì)。迄今，課題組已發(fā)展了十余種小分子新基質(zhì)，這些成果為第二步研究——高通量質(zhì)譜成像奠定了工作基礎(chǔ)。
質(zhì)譜成像：無(wú)標(biāo)記多組分 知其然并知其所以然
首先，聶宗秀為我們普及了一些質(zhì)譜成像的背景知識(shí)。
1997年，范德堡大學(xué)（Vanderbilt University）的Richard Caprioli等首次報(bào)道質(zhì)譜成像的工作。成像的方法很多，應(yīng)用最廣泛的是得過(guò)Nobel獎(jiǎng)的熒光成像。熒光的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度非常高，但需要標(biāo)記，通過(guò)跟蹤標(biāo)記分子來(lái)間接測(cè)量目標(biāo)物。如果標(biāo)記分子脫落，可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成錯(cuò)判或誤判。質(zhì)譜成像最大的優(yōu)點(diǎn)就是免標(biāo)記，另一大優(yōu)點(diǎn)是多組分同時(shí)測(cè)量，第三個(gè)優(yōu)點(diǎn)是“知其然并知其所以然”，這是其它任何技術(shù)都做不到的。每個(gè)分子都有一個(gè)特異性指標(biāo)即分子量，質(zhì)譜在獲得成像的同時(shí)，測(cè)定了成像區(qū)域各分子的分子量，并可通過(guò)碎片譜MS/MS獲得更多豐富的結(jié)構(gòu)信息。
打個(gè)比方來(lái)說(shuō)，照片反映了光的強(qiáng)弱，是光在二維空間的分布；而質(zhì)譜成像反映了物質(zhì)的強(qiáng)弱，是物質(zhì)在二維空間的分布。迄今化學(xué)家合成了2300多萬(wàn)種物質(zhì)，用質(zhì)譜成像可以區(qū)分各種不同物質(zhì)的分布，這是“知其然并知其所以然”，哪些區(qū)域成像強(qiáng)度高，是什么分子造成的，都能分析得清清楚楚。
自Caprioli第一個(gè)報(bào)道質(zhì)譜成像后，成像技術(shù)發(fā)展很快，包括：MALDI成像、DESI成像、SIMS（二次離子）成像，三種方式各有其優(yōu)缺點(diǎn)。其中，分辨率最高的是SIMS，空間分辨率可達(dá)幾十納米量級(jí)，但離子束能量高、離子源太“硬”，較難得到完整的分子離子峰。DESI的好處是可在常壓下操作，比較容易實(shí)驗(yàn)，但空間分辨率在100μm以上。MALDI正好介于兩者之間，分辨率1-10μm?！俺朔直媛屎碗x子源性能的考慮，我們想做組織成像，看組織分布MALDI最合適，而且今后在醫(yī)院臨床，我認(rèn)為組織成像最有前途的也是MALDI技術(shù)?！甭欁谛阏f(shuō)，“國(guó)內(nèi)有很多優(yōu)秀學(xué)者開(kāi)展質(zhì)譜成像研究，取得了非常好的研究結(jié)果。總的來(lái)說(shuō)，這三種技術(shù)相互配合，離開(kāi)哪個(gè)都不行?！?
課題組的MALDI成像工作
“我們?cè)谫|(zhì)譜成像方面開(kāi)展的研究工作，在我回到中科院化學(xué)所之后開(kāi)始的，“主要是兩方面工作，發(fā)展新基質(zhì)，及質(zhì)譜成像。由于我們有做顆粒質(zhì)譜的背景，才有用MALDI成像技術(shù)分析病毒、細(xì)胞、細(xì)菌，或更小的顆粒如納米材料的想法。”
納米材料廣泛應(yīng)用于組織工程學(xué)、生物等各種領(lǐng)域，這為分析化學(xué)工作者提供一個(gè)契機(jī)。材料學(xué)家合成很厲害，但他們迫切需要了解材料在體內(nèi)的分布和其毒性，就會(huì)同分析化學(xué)家合作。以前，用質(zhì)譜研究納米材料的分布很難。首先，納米材料的質(zhì)量范圍超出了商用儀器的研究范圍；其次體內(nèi)很多內(nèi)源性小分子會(huì)干擾納米材料的測(cè)定；第三點(diǎn)是生物體內(nèi)環(huán)境很復(fù)雜，納米材料解吸附、電離比較困難。當(dāng)時(shí)課題組參加了萬(wàn)立駿院士的項(xiàng)目就是做質(zhì)譜成像；購(gòu)置了布魯克公司的ultrafleXtreme MALDI TOF/TOF高通量MALDI質(zhì)譜儀，目標(biāo)就是做納米材料的質(zhì)譜成像。
ultrafleXtreme MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀
首先，我們發(fā)現(xiàn)用激光濺射碳納米管時(shí)，小分子區(qū)域中有很多貌似像雜峰的指紋峰，查了很多文獻(xiàn)，都認(rèn)為它們來(lái)自于樣品雜質(zhì)，或來(lái)自不干凈的腔體表面。但進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這些峰重復(fù)性很好，非常奇怪，就想把這事搞清楚。我們嘗試很多方法進(jìn)一步凈化樣品，把腔體也擦得干干凈凈，但仍有這些峰；因此懷疑它們來(lái)源于樣品本身。最后通過(guò)仔細(xì)研究發(fā)現(xiàn)，這是m/z 12、24、36、48的一組峰，每個(gè)峰間質(zhì)量數(shù)正好差12，是碳的原子量，因此這組峰是碳材料本身的團(tuán)簇離子質(zhì)譜峰。我們就巧妙地將高質(zhì)量數(shù)窗口移到低質(zhì)量窗口，解決了碳納米材料的探測(cè)的問(wèn)題。
第二問(wèn)題是如何解決內(nèi)源性小分子干擾的問(wèn)題。我們發(fā)現(xiàn)，改變激光波長(zhǎng)比如當(dāng)選擇355 nm的紫外激光時(shí)沒(méi)有干擾，這是因?yàn)閮?nèi)源性小分子對(duì)355 nm激光吸收不多。我們把碳納米管通過(guò)小鼠尾經(jīng)脈注入其體內(nèi)后，用355 nm激光進(jìn)行質(zhì)譜成像，得到同純材料非常類似的模式（Pattern）。因此選擇合適的激光波長(zhǎng)可解決內(nèi)源性小分子干擾問(wèn)題，我們成功建立了納米材料在體內(nèi)成像的方法。突破了上述幾大難點(diǎn)后，以后的定量、研究納米材料分布、在亞器官的分布就獲得了較好的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。該工作很快被《Nature Nanotechnology》接受。
小鼠肺組織切片MoS2納米片的LDI MS成像
納米材料可用作藥物載體，我們最近用質(zhì)譜成像技術(shù)研究納米載體藥物的釋放。我們選擇硫化鉬納米材料，觀察硫化鉬的信號(hào)即可得到納米材料在體內(nèi)的分布。選擇的藥物是紫杉醇，觀察其信號(hào)可得到藥物在體內(nèi)的分布。我們用質(zhì)譜成像發(fā)現(xiàn)了一個(gè)有趣的現(xiàn)象：一般人認(rèn)為腫瘤里面的材料多，但通過(guò)質(zhì)譜成像發(fā)現(xiàn)，腫瘤里的材料很少，正常組織中材料多；腫瘤組織里面藥物釋放多，正常組織藥物釋放少，與人們想象的結(jié)果相反。
小鼠經(jīng)24小時(shí)靜脈注射后肝臟組織中MoS2納米片的分布及其有效抗癌藥物DOX的原位H22腫瘤模型圖像
對(duì)質(zhì)譜成像生產(chǎn)廠家的建議
對(duì)當(dāng)前臨床所用MALDI-TOF微生物質(zhì)譜，聶宗秀認(rèn)為從質(zhì)譜技術(shù)上來(lái)看，這些都是線性模式TOF，可以說(shuō)是相對(duì)比較簡(jiǎn)單的一種TOF。前一陣子有十幾家國(guó)內(nèi)廠家都紛紛推出微生物檢測(cè)MALDI-TOF，表明技術(shù)上并無(wú)太高的門(mén)檻，聶宗秀表達(dá)了自己隱隱的擔(dān)心：過(guò)多廠商蜂擁而上會(huì)造成惡性低價(jià)競(jìng)爭(zhēng)，最終影響產(chǎn)品質(zhì)量。
目前反射模式的高分辨MALDI-TOF和高分辨MALDI TOF/TOF，尤其是適合高通量質(zhì)譜成像研究的質(zhì)譜，還只有少數(shù)廠家可以提供。從用戶角度，聶宗秀對(duì)MALDI質(zhì)譜成像廠家提出三點(diǎn)建議。首先，TOF為獲得超高分辨率，需要很強(qiáng)的電場(chǎng)，除了加很高的電壓外，縮小了靶板與地之間的距離，希望在做高分辨時(shí)，兼顧質(zhì)譜分辨率與用戶需求，盡可能增加靶板與地的空間距離。其次在做成像時(shí)，激光打靶的時(shí)間很長(zhǎng)，打出的是等離子體，而等離子體慢慢會(huì)導(dǎo)電，影響高壓的壽命及穩(wěn)定性而進(jìn)一步影響質(zhì)譜的穩(wěn)定性，希望在技術(shù)上加以改進(jìn)； 第三，現(xiàn)在商用激光器的激光波長(zhǎng)都設(shè)在355 nm處，希望開(kāi)發(fā)激光波長(zhǎng)可調(diào)的質(zhì)譜儀。
課題組研發(fā)的質(zhì)譜技術(shù)
除了使用商品化質(zhì)譜做應(yīng)用，聶宗秀課題組也研發(fā)了一些產(chǎn)業(yè)化前期的質(zhì)譜。比如便攜式顆粒質(zhì)譜儀，以及采用二次流技術(shù)的基質(zhì)噴霧儀。關(guān)于基質(zhì)噴霧儀，聶老師介紹了其原理。
基質(zhì)在組織切片上分布的均勻度、結(jié)晶度和晶體顆粒的大小等因素是決定質(zhì)譜成像質(zhì)量的關(guān)鍵因素之一。目前，MALDI（基質(zhì)輔助激光解吸電離）質(zhì)譜成像研究中常用的基質(zhì)附著方法是采用商業(yè)化、非常昂貴的基質(zhì)二次流沉積設(shè)備來(lái)進(jìn)行，二次流方法使用氣流（一次流）產(chǎn)生的小液滴（二次流），液滴大小難于控制、尺寸不均會(huì)影響分辨率。進(jìn)行質(zhì)譜成像希望的理想情況是：一個(gè)分子外面包裹一層薄薄的單分子層的基質(zhì)，噴霧越均勻，基質(zhì)層越薄成像效果就越好。課題組使用了一臺(tái)價(jià)格低于5美元的迷你加濕器，采用超聲噴霧方法，研發(fā)了超聲噴霧儀，通過(guò)精確控制超聲波的頻率即可得到均勻大小的顆粒，改變頻率可調(diào)節(jié)顆粒尺寸，頻率越高顆粒尺寸越小。該設(shè)備提供了更高的靈敏度和更小的基質(zhì)晶體（直徑小于10 μm），可獲得10μm空間分辨率的高質(zhì)量離子圖像。事實(shí)證明，超聲噴霧的方法靈敏度和成像質(zhì)量都得到大幅提高。課題組用MALDI-MS/MS成像以分離小鼠腦中的兩種脂質(zhì)。
人物簡(jiǎn)介：
聶宗秀，中科院化學(xué)所研究員，國(guó)家杰出青年基金獲得者。以顆粒質(zhì)譜構(gòu)建及小分子代謝產(chǎn)物質(zhì)譜為主要研究方向，針對(duì)質(zhì)譜在顆粒分析存在的關(guān)鍵科學(xué)與技術(shù)問(wèn)題，在質(zhì)譜儀器構(gòu)建及應(yīng)用等方面進(jìn)行了系統(tǒng)探索研究。設(shè)計(jì)研制了多種顆粒離子化源及電荷探測(cè)器，構(gòu)建了離子阱顆粒質(zhì)譜裝置平臺(tái)，對(duì)微納尺度顆粒進(jìn)行了多參數(shù)表征；建立了基于指紋質(zhì)譜的顆粒分析方法，獲得了納米顆粒的生物組織質(zhì)譜成像，將質(zhì)譜質(zhì)量范圍拓寬了8個(gè)數(shù)量級(jí)，從分子質(zhì)譜的10e6 Da至顆粒的10e14 Da；合成和發(fā)現(xiàn)了系列MALDI新基質(zhì)，獲得了多種動(dòng)物模型下的代謝小分子質(zhì)譜成像。獨(dú)立工作以來(lái)，發(fā)表通訊作者論文62篇，其中包括1篇Nature Nanotech.、1篇Science Adv.、17篇Anal. Chem.、6篇Chem. Commu.、2篇Chem. Eur. J. 。發(fā)表在Nature Nanotech.上的工作，由雜志社撰文在同期的“新聞視角”中進(jìn)行了專欄評(píng)論，被Chem. Res. Toxicol.選為“研究亮點(diǎn)”，入選2016年Nature Nanotech.雜志10周年?？?。授權(quán)中國(guó)發(fā)明專利21項(xiàng)。
